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Jun 23, 2023

ARNm administrado por vía intradérmica

Naturaleza Ingeniería Biomédica

Nature Biomedical Engineering (2023)Citar este artículo

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El éxito de las terapias con ARN mensajero depende en gran medida de la disponibilidad de sistemas de administración que permitan la traducción segura, eficaz y estable del material genético en proteínas funcionales. Aquí mostramos que las vesículas extracelulares (EV) producidas a través de la nanoporación celular a partir de fibroblastos dérmicos humanos y la encapsulación del ARNm que codifica para el colágeno tipo I α1 de matriz extracelular (COL1A1) indujeron la formación de injertos de proteína de colágeno y redujeron la formación de arrugas en el colágeno- tejido dérmico empobrecido de ratones con piel fotoenvejecida. También mostramos que la administración intradérmica de los EV cargados de ARNm a través de una matriz de microagujas condujo a la síntesis y reemplazo prolongados y más uniformes de colágeno en la dermis de los animales. La administración intradérmica de ARNm de COL1A1 basado en EV puede convertirse en una terapia de reemplazo de proteínas eficaz para el tratamiento de la piel fotoenvejecida.

Los desarrollos recientes en las técnicas de modificación del ARN mensajero han mejorado la eficiencia terapéutica de la entrega de ARNm y su potencial para aplicaciones clínicas a corto plazo, incluida la terapia de reemplazo de proteínas y la vacunación contra el virus del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1, 2. Sin embargo, la incapacidad intrínseca y la inmunogenicidad potencial de los ARNm requieren que se encapsulen dentro de los vehículos de administración. Las modalidades actuales de entrega de ARNm se centran en el uso de portadores de nanopartículas lipídicas (LNP) para la encapsulación y el transporte3,4. Sin embargo, los LNP plantean varios desafíos importantes, incluida la citotoxicidad, la biodistribución deficiente, la falta de especificidad e inmunogenicidad del objetivo. Estos problemas pueden deberse al requisito de la PEGilación superficial (PEG significa poli(etilenglicol)) de los LNP para mejorar su vida media circulatoria y reducir el aclaramiento no específico5,6. En particular, la administración de LNP en personas se ha relacionado con anafilaxia, hipersensibilidad y eventos adversos autoinmunes7,8. Por lo tanto, la identificación de portadores de ARNm que puedan superar algunos de estos desafíos asociados con LNP sería útil para el desarrollo posterior de terapias basadas en ARNm.

Las vesículas extracelulares (EV), incluidos los exosomas y las microvesículas, desempeñan un papel importante en el transporte de biomoléculas y ácidos nucleicos, incluidos los ARNm, dentro del cuerpo humano9,10,11. Como resultado, en los últimos años, los vehículos eléctricos se han convertido en portadores prometedores de terapias basadas en ácidos nucleicos debido a su biocompatibilidad intrínseca, su capacidad para cruzar barreras fisiológicas y su baja inmunogenicidad12,13. A diferencia de los LNP, los EV, incluidos los exosomas, son producidos endógenamente por las células del cuerpo y conducen a niveles más bajos de respuestas inflamatorias. Además, se han desarrollado estrategias para producir grandes cantidades de exosomas de forma económica y sencilla. Anteriormente informamos sobre un método de nanoporación celular (CNP) en el que se crearon poros nanométricos transitorios en la superficie de las células fuente para permitir la carga a gran escala de ARNm de transcripción completa en EV14 secretados. Aquí, mediante el uso de un modelo de ratón de fotoenvejecimiento agudo que imita de cerca las características fisiopatológicas de la piel dañada por el envejecimiento en humanos15, mostramos la utilidad de la terapia de ARNm de COL1A1 basada en exosomas para reemplazar la pérdida de proteína de colágeno dérmica como un tratamiento antienvejecimiento para el fotoenvejecimiento. piel. Para mejorar la eficiencia de la entrega y retención de ARNm, también mostramos que la entrega de ARNm de colágeno a través de un parche de microaguja de ácido hialurónico (HA) (COL1A1-EV MN) permite una distribución más eficiente de ARNm en la dermis, lo que da como resultado colágeno duradero. -injerto de proteínas y en un mejor tratamiento de las arrugas en pieles fotoenvejecidas.

La atrofia dérmica debida a la pérdida irreversible de colágeno es un sello distintivo del envejecimiento de la piel16,17. Numerosos métodos han tenido como objetivo restaurar la pérdida de proteína de colágeno en la piel, que van desde enfoques farmacéuticos y de venta libre (antioxidantes18,19,20, retinoides21, péptidos22,23) hasta dispositivos médicos (es decir, terapia con láser24 y rellenos dérmicos sintéticos25,26) . Sin embargo, ninguna de estas tecnologías existentes ha sido capaz de lograr el reemplazo de colágeno endógeno a largo plazo para mantener la fuerza, firmeza y elasticidad de la piel a lo largo del tiempo27,28,29. Estimular los fibroblastos responsables de sintetizar las proteínas de colágeno también puede ser una forma eficaz de controlar a corto plazo el envejecimiento de la piel30. Sin embargo, los fibroblastos pierden gradualmente su capacidad para proliferar y sintetizar colágeno a medida que envejecen, lo que genera desafíos para los métodos a largo plazo de reemplazo de colágeno para el tratamiento antienvejecimiento31. Para superar estas limitaciones, nuestro objetivo fue reemplazar la proteína de colágeno en un modelo de agotamiento de colágeno por fotoenvejecimiento a través de la entrega de ARNm mediada por EV. Para generar vehículos eléctricos cargados con ARNm de colágeno I alfa I humano (COL1A1), empleamos una técnica de CNP que implicó sembrar una monocapa de fibroblastos dérmicos humanos neonatales (nHDF) en una superficie de nanoporos y nanotransfectar las células con un plásmido COL1A1-GFP ( Fig. 1a y Fig. complementaria 1a)14. Los vehículos eléctricos se aislaron de los medios de cultivo el día después de la transfección. Se encontró que las células tratadas con CNP tenían un número de EV 10 veces mayor por célula en comparación con las células tratadas con electroporación a granel estándar (BEP), que se realizó utilizando electrodos paralelos tipo cubeta como se describió previamente32, o nHDF no tratadas en cultivo (Fig. .1b). Los EV producidos por cada método se caracterizaron por una distribución de tamaño con un pico de aproximadamente 150 nm de diámetro según lo determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y el 80% de la intensidad en el pico de modo por dispersión de luz dinámica (DLS) (Fig. 1c y Suplementario Fig. 1b,c) con un índice de polidispersidad (PDI) de 0,12-0,25. Los experimentos de transferencia Western mostraron que las expresiones de biomarcadores de exosomas (CD9, CD63, TSG101) y microvesículas (ARF6) en el grupo tratado con CNP fueron significativamente más altas que en el grupo no tratado, lo que confirma el aumento de los vehículos eléctricos secretados (Figura complementaria 1d). Los análisis cinéticos mostraron además que la liberación de EV optimizada por voltaje alcanzó su punto máximo a las 8 h después de la inducción de CNP, y se observó una secreción continua durante las siguientes 24 h (Fig. 1e, f complementaria). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) mostró que los EV secretados por CNP contenían más de 200 veces el ARNm de COL1A1 que los EV secretados por BEP y 3000 veces más ARNm de COL1A1 que los EV secretados por células no transfectadas (Fig. 1d ). La evaluación del bioanalizador de gel de agarosa demostró ARNm de COL1A1 transcrito de longitud completa en ~ 4000 nucleótidos (Fig. 1e). Los vehículos eléctricos preparados por CNP exhibieron estabilidad estructural cuando se almacenaron para administración preclínica a 4 °C sin cambios en la apariencia, la membrana y las propiedades de tamaño cuando se evaluaron mediante microscopía crioelectrónica (crio-EM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y NTA (Fig. .2a–c). Además, el ARNm de COL1A1 encapsulado dentro de los vehículos eléctricos fue estable tanto a temperatura ambiente como a 4 °C, y también exhibió estabilidad sérica, lo que destaca su potencial de utilidad clínica futura (Figura complementaria 2d, e).

a, Representación esquemática de los vehículos eléctricos generados por CNP para la administración de ácidos nucleicos dirigidos. b, número de EV por célula producida por nHDF no tratadas en tampón PBS como control, BEP o CNP con tampón PBS solo en 24 h (n = 3 para cada grupo; *P = 0,048 Control frente a BEP; **P = 0,005 Control frente a CNP ; ##P = 0,002 BEP frente a CNP). c, Caracterización de vehículos eléctricos mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. d, la RT-qPCR del ARNm de COL1A1 revela que los vehículos eléctricos producidos por CNP contienen cantidades mucho mayores de ARNm transcritos que los vehículos eléctricos producidos por los grupos BEP y Control en 24 h (n = 3 para todos los grupos; **P = 0,002 Control frente a BEP; * **P < 0,001 Control frente a CNP; ###P < 0,001 BEP frente a CNP). e, Electroforesis en gel del ARN total extraído de 3,78 × 108 EV producidos a partir de CNP utilizando el plásmido COL1A1-GFP en comparación con el ARNm de COL1A1 transcrito in vitro sintético como control. f, Proliferación de nHDF después del tratamiento con diferentes concentraciones de proteína de COL1A1-EV a las 0 h, 24 h y 48 h (n = 4 para todos los grupos; a las 24 h: #P = 0,0107, 10 µg ml−1 frente a 0 µg ml −1 de concentración de proteína de COL1A1-EV después del tratamiento; ##P = 0,002, 20 µg ml−1 frente a 0 µg ml−1; ###P < 0,001, 30 µg ml−1 frente a 0 µg ml−1; en 48 h: *P = 0,045, 10 µg ml−1 frente a 0 µg ml−1 de tratamiento con COL1A1-EV, ***P < 0,001, 20 µg ml−1 frente a 0 µg ml−1, ***P < 0,001 , 30 µg ml−1 frente a 0 µg ml−1). Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem. Se usaron pruebas t de Student de dos caras para las comparaciones en b y d. Se utilizó ANOVA de una vía para las comparaciones en f. El esquema en a fue creado con BioRender.com.

Para evaluar el potencial terapéutico de los EV que contienen ARNm de COL1A1 (COL1A1-EV) in vitro, tratamos fibroblastos cultivados con COL1A1-EV durante 48 h (Fig. 3a complementaria). Se observó que la proliferación de fibroblastos aumentaba con el tratamiento con COL1A1-EV de manera dependiente de la dosis (Fig. 1f). Después del tratamiento, se observó una expresión elevada de la proteína COL1A1 en fibroblastos tratados con COL1A1-EV, como lo demuestra el aumento de la coubicación de la proteína verde fluorescente (GFP) con COL1A1 bajo microscopía de inmunofluorescencia. En contraste, los niveles de COL1A1 fueron sustancialmente más bajos sin la co-localización de GFP en el grupo no tratado (Datos extendidos Fig. 1a, b). La entrega exitosa de ARNm en las células receptoras se confirmó aún más por la expresión elevada de ARNm de colágeno y los niveles de proteína de colágeno medidos mediante PCR cuantitativo y análisis de transferencia Western, respectivamente, en fibroblastos tratados con COL1A1-EV (Datos extendidos Fig. 1c, d y Fig. 3b complementaria) . Además, el pro-colágeno I, un precursor de la proteína COL1, aumentó significativamente después del tratamiento con COL1A1-EV, lo que indica una síntesis mejorada de la proteína COL1 por parte de los fibroblastos tratados con EV en comparación con los fibroblastos no tratados (Datos extendidos Fig. 1e). Las imágenes de microscopía confocal de la captación celular de vehículos eléctricos indicaron que la entrega de carga de vehículos eléctricos en las células receptoras está mediada por endocitosis mediada por clatrina (Figura complementaria 3c, d) y es capaz de escapar de los lisosomas (Figura complementaria 4). Tomados en conjunto, estos hallazgos demuestran que el ARNm de COL1A1 funcional puede encapsularse de manera estable dentro de los EV mediante CNP y que este sistema de administración de COL1A1-EV puede aumentar significativamente la expresión de la proteína COL1A1 in vitro.

Para comprender la cinética del suministro de ARNm de COL1A1 mediado por EV y la formación de proteínas in vivo, administramos 2,7 × 109 copias del ARNm de COL1A1 COL1A1-EV en la dermis de los ratones a través de una jeringa con aguja de insulina. Los ratones se sacrificaron durante los siguientes 14 días para el análisis histológico mediante RNAscope para la cuantificación del ARNm de COL1A1. Se encontró que el ARNm de COL1A1 estaba significativamente elevado en el tejido de la piel local a las 12 horas después del parto, con disminuciones notables observadas a las 24 y 48 horas después de la inyección, y un retorno a los niveles de ARNm de COL1A1 basales a las 96 horas (Fig. 2a, b). La traducción in vivo del ARNm de COL1A1 en proteína se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia del tejido explantado durante un período de 30 días. Los injertos inmunoteñidos con GFP+ COL1A1+ se observaron tan pronto como 12 h después de la inyección, con un pico de fluorescencia a los 4 días después del parto (Fig. 2c-e). Se observó que los injertos de proteína GFP+ COL1A1+ disminuyeron de manera dependiente del tiempo desde el día 4 hasta el día 30 después de la inyección, según se observó mediante microscopía de inmunofluorescencia, y la mayoría de la proteína derivada de COL1A1-EV se transformó en el día 30. Estos hallazgos demuestran que las dosis más bajas de la entrega de COL1A1-EV da como resultado un pico de 3 a 4 días de la proteína COL1A1 en los tejidos receptores, que disminuye a los niveles iniciales el día 30 después de la inyección.

a, Hibridación in situ de ARNm de COL1A1 humano por RNAscope después de la inyección intradérmica de COL1A1-EV y control de solución salina, medido a las 12 h, 24 h, 48 h, 96 h, 7 d, 10 d y 14 d después de la inyección. Barra de escala, 100 µm. b, Cuantificación de los resultados de RNAscope por número promedio de puntos marrones por celda. c, Inmunofluorescencia a lo largo del tiempo de la proteína derivada de COL1A1-EV mediante la visualización de la proteína GFP y COL1A1 co-localizada (RFP). Barra de escala, 100 µm. d, Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de la expresión de la proteína COL1A1-GFP. e, la cuantificación de células GFP+ confirma que los injertos de proteína derivados de COL1A1-EV disminuyen de manera dependiente del tiempo durante 30 días. Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem

El fotoenvejecimiento dérmico se caracteriza por la destrucción del colágeno y las proteínas de la matriz extracelular (MEC) en la piel por la exposición al sol y la radiación UV, lo que provoca la formación de arrugas33,34. Para evaluar la capacidad de los vehículos eléctricos de ARNm de COL1A1 para reemplazar la proteína de colágeno degradada in vivo, empleamos un modelo de fotoenvejecimiento descrito anteriormente en el que los ratones desnudos atímicos se trataron con radiación UV (311 nm) durante un período de 8 semanas, lo que resultó en arrugas dérmicas secundarias al colágeno. agotamiento35 (Fig. 5a complementaria). La eficacia del curso de irradiación UV de 8 semanas en la degradación de las fibras de colágeno y elastina en la piel murina se confirmó mediante análisis histológico y de tejidos (Fig. 5b-g complementaria). A continuación, evaluamos el potencial terapéutico de COL1A1-EV para reemplazar el colágeno dérmico en ratones irradiados con UV al tratar a los animales con un ciclo de inyección 5x de: (1) 2,7 × 109 número de copias de ARNm de COL1A1 encapsulado en EV (COL1A1-EV) , (2) 2,7 × 109 número de copias de ARNm de COL1A1 encapsulado en nanopartículas lipídicas (COL1A1-LNP), (3) EV de control sin carga de carga de CNP (EV descargados), (4) tratamiento tópico con ácido retinoico al 0,05 % (AR) o ( 5) control salino. Se realizó un seguimiento de la formación de arrugas los días 0, 4, 7, 14, 21 y 28 después del inicio del tratamiento, y todos los animales se sacrificaron el día 28 para análisis histológicos y de réplicas de yeso cutáneo36 (Fig. 3a). La fotografía microscópica de las arrugas de la piel dérmica durante el período de tratamiento demostró disminuciones modestas en el número y el área de las arrugas para el día 28 para los grupos COL1A1-LNP, EV descargados y ácido retinoico en comparación con el grupo de control de solución salina (Fig. 3b). Por el contrario, los ratones fotoenvejecidos tratados con COL1A1-EV mostraron una reducción en el número y el área de las arrugas a partir del día 7 después del inicio del tratamiento, con una reducción significativa a partir del día 14 en adelante a niveles similares a los observados en los controles simulados no irradiados (Fig. 3c,d ). Las réplicas de yeso cutáneo de la piel dorsal tomadas el día 28 después del inicio del tratamiento confirmaron la eficacia de COL1A1-EV para tratar la piel fotoenvejecida en comparación con el control de solución salina, ácido retinoico, controles EV sin carga y COL1A1-LNP (datos ampliados, figura 2). Cabe destacar que los COL1A1-LNP también exhibieron una reducción en el número y el área de las arrugas en comparación con el control de solución salina, el ácido retinoico y los controles EV descargados, aunque este efecto no fue tan pronunciado como con los COL1A1-EV. La piel tratada con COL1A1-EV y COL1A1-LNP también demostró una mayor elasticidad y firmeza, según lo medido por un cutómetro y un extensómetro Instron, respectivamente (Fig. 6 complementaria).

a, Representación esquemática y cronología de 5 inyecciones de dosis baja de COL1A1-EV (2,7 × 109 número de copias de ARNm de COL1A1 por dosis). El tejido de la piel se recogió a los 28 d. b, se realizó un seguimiento de la formación de arrugas los días 0, 4, 7, 14, 21 y 28 después de la administración inicial de COL1A1-EV, COL1A1-LNP, EV descargados, ácido retinoico (AR) al 0,05 % o solución salina (n = 4 para todos los grupos ). El grupo simulado comprendía ratones desnudos hembra que no fueron expuestos a la radiación ultravioleta. Barra de escala, 5 mm. c, Número total de arrugas en la piel del dorso cuantificadas con software personalizado (n = 4 para todos los grupos; ※※P = 0,0016 COL1A1-EV frente a solución salina en el día 7; ※※※P < 0,001 COL1A1-EV frente a solución salina en el día 14, 21 y 28; **P = 0,0089 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 21; **P = 0,0097 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 28; #P = 0,461 EV sin carga frente a solución salina el día 21; ##P = 0,0034 sin carga EV frente a solución salina el día 28; †P = 0,0142 RA frente a solución salina el día 21; ††P = 0,0069 RA frente a solución salina el día 28). d, Cuantificación del área de arrugas en la piel dorsal (n = 4 para todos los grupos; ※※P = 0,0063 COL1A1-EVs frente a solución salina el día 7; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs frente a solución salina los días 14, 21 y 28; **P = 0,0082 COL1A1-LNPs frente a solución salina el día 21; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs frente a solución salina el día 28; ††P = 0,0040 RA frente a solución salina el día 28; ##P = 0,0018 EV descargados frente a solución salina en el día 28). Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem Se utilizó ANOVA de dos vías para las comparaciones en c y d. El esquema en a fue creado con BioRender.com.

Para evaluar los efectos secundarios inmunogénicos de COL1A1-LNP y COL1A1-EV, se extirpó la piel tratada de un subgrupo de animales y se analizó la inflamación 24 h después de la inyección. La piel tratada con COL1A1-LNP mostró enrojecimiento e hinchazón en comparación con los controles simulados y la piel tratada con COL1A1-EV (datos extendidos, figura 3a). La citometría de flujo y el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) del tejido revelaron además un infiltrado leucocitario masivo dominado por neutrófilos en el tejido que recibió COL1A1-LNP (datos extendidos, Fig. 3b, c) y altos niveles de citoquinas inflamatorias como TNF-α, IL- 6, IL-1β e IFN-γ (datos extendidos Fig. 3d-f). En comparación, el tejido que recibió tratamiento con COL1A1-EV no mostró una fuerte reacción inflamatoria. Estos hallazgos sugieren que los LNP son sustancialmente más inmunogénicos que los EV.

Después de la evaluación en el día 28, se retuvo un subconjunto de animales durante 4 semanas adicionales para monitorear la duración de la reducción de arrugas. Se observó que las arrugas dérmicas reaparecían tan pronto como 1 semana después, comenzando el día 35 después del inicio del tratamiento, y para el día 56, las arrugas dérmicas eran estadísticamente indistinguibles de los niveles previos al tratamiento (Datos ampliados, Fig. 4).

Para evaluar el injerto dérmico de colágeno del suministro de COL1A1-EV, se extirpó la piel de todos los grupos el día 28 después del inicio del tratamiento y se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia, así como tinción tricrómica de Masson. El análisis histológico y la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia revelaron que la expresión de la proteína COL1A1 se restauró significativamente después del tratamiento con COL1A1-EV en relación con otros grupos (Fig. 4a, b). La tinción con tricrómico de Masson confirmó niveles más altos de tinción de colágeno y espesor dérmico (197,95 ± 24,46 μm COL1A1-EV frente a 95,19 ± 10,66 μm de solución salina el día 28, P < 0,001) en ratones que recibieron COL1A1-EV que en ratones que recibieron control de solución salina, ácido retinoico, EV descargados o COL1A1-LNP (Fig. 4c, d).

a, tinción de inmunofluorescencia para proteína GFP y COL1A1 (RFP) en el grupo de control simulado, grupo de control de solución salina, grupo de tratamiento de AR, grupo de tratamiento EV descargado, grupos de tratamiento COL1A1-LNP y COL1A1-EV. Los ratones tratados con COL1A1-EV exhibieron injertos de proteína GFP+ COL1A1 en la dermis y subcutis a los 28 días después del inicio del tratamiento. Barra de escala, 200 µm. b, Intensidad de fluorescencia de la proteína COL1A1 (RFP) para todos los grupos de tratamiento (n = 3 para todos los grupos; ※※※P < 0,001 COL1A1-EV frente a solución salina; ***P < 0,001 COL1A1-LNP frente a solución salina; #P = 0,0386 EV descargados frente a solución salina; †P = 0,0218 RA frente a solución salina; +P = 0,0255 COL1A1-EV frente a COL1A1-LNP). c, Tinción representativa de colágeno tricrómico de Masson de la epidermis, dermis y tejido subcutáneo para todos los grupos de ratones. El colágeno es azul. Barra de escala, 200 µm. d, Cuantificación del grosor dérmico que muestra un aumento de las fibras de colágeno en el grupo COL1A1-EV (n = 3 para todos los grupos; ※※※P < 0,001 COL1A1-EV frente a solución salina; ***P < 0,001 COL1A1-LNP frente a solución salina; #P = 0,0437 EV descargados frente a solución salina; †P = 0,0447 RA frente a solución salina; +++P < 0,001 COL1A1-EV frente a COL1A1-LNP). Todos los datos provienen de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem. Se utilizó ANOVA unidireccional para las comparaciones en b y d.

Como se descubrió que las arrugas volvían a los niveles iniciales en animales fotoenvejecidos dentro de 1 mes de la interrupción del tratamiento con COLA1-EV, nuestro objetivo fue mejorar la duración del reemplazo de proteínas y la efectividad del injerto de colágeno mediante el diseño de una formulación de microagujas de HA (COL1A1-EV MN) para mejorar la entrega de tejido de ARNm mediada por EV. Se prepararon parches personalizados con microagujas utilizando un método de micromoldeado en el que se mezclaron COL1A1-EV con una solución de HA al 15 % disuelta en PBS y se colaron en las puntas de un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) manteniendo el vacío durante 30 min, después de lo cual se mezcló 1 ml Se colocó una solución de HA al 15% en peso en el micromolde y luego se transfirió a 4 ° C durante 4 h para la solidificación (Fig. 5a). Cada aguja del parche de microagujas COL1A1-EV se moldeó en forma cónica, con un diámetro circular de 400 µm en su base y una altura de 1000 µm (Fig. 5b). La resistencia mecánica de los parches con 10 %, 15 % o 20 % de HA cargados con EV se evaluó con una máquina de prueba de tracción (Figura complementaria 7a). Se confirmó que la fuerza de fractura por carga de nuestro COL1A1-EV MN al 15 % era más alta que la fuerza promedio mínima necesaria para la penetración de la piel (0,058 N)37 (Fig. 7b complementaria). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) confirmó que las microagujas penetraron a través del estrato córneo hacia la dermis (516 ± 76 μm)38 (Fig. 5c). Se descubrió que COL1A1-EV cargados en microagujas HA tenían una apariencia estable e integridad de la membrana según lo evaluado por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y AFM, así como ARNm COL1A1 estable y distribución del tamaño de partícula (Fig. 7c-f complementaria). Para la entrega en el tejido, los parches COL1A1-EV MN se presionaron en la piel dorsal de los ratones y la base de la microaguja se retiró después de 15 minutos (Video complementario 1). Durante este período, las microagujas se disolvieron por completo, sin irritación visible de la piel ni marcas en el sitio de administración (Fig. 5d y Video complementario 2). Para comparar la distribución tisular de los EV administrados a través de una microaguja con la de los EV administrados con una jeringa de insulina, los EV se etiquetaron con DiI (perclorato de 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina; Beyotime, C1036)39 y se administró por vía intradérmica debajo de la piel dorsal de los ratones receptores, con una evaluación histológica posterior mediante microscopía de inmunofluorescencia (Fig. 5e y Fig. 8a, b complementaria). El análisis de distribución de tejidos reveló que la inyección con aguja de jeringa dio como resultado una administración desigual de EV con aglutinación en áreas específicas de la dermis y el tejido subcutáneo, mientras que los EV administrados por microagujas se dispersaron mejor en la dermis y el tejido subcutáneo (Fig. 5f y Fig. 8c,d suplementaria). . La evaluación de la integridad de la membrana EV por crio-EM mostró menos lisis de la membrana EV en los EV administrados con el parche de microagujas frente a la aguja de la jeringa (18,1 ± 3,0 % COL1A1-EV MN frente a 28,3 ± 2,4 % inyección con aguja, P = 0,022) (Fig. 8e,f). Para evaluar si la distribución mejorada del tejido y la protección de la membrana EV dieron como resultado un injerto EV mejorado, a continuación empleamos imágenes de fluorescencia in vivo en serie de EV marcados con DiI inyectados por vía intradérmica en ratones durante un período de 14 días. Las imágenes de fluorescencia confirmaron una señal DiI EV similar entre los vehículos eléctricos administrados con jeringa y los vehículos eléctricos administrados con microagujas durante los primeros 4 días después de la inyección. Sin embargo, el grupo de microagujas COL1A1-EV tuvo una señal de fluorescencia significativamente más alta el día 4 (69,61 ± 6,4 % COL1A1-EV MN frente a 45,79 ± 2,5 % inyección con aguja, P < 0,001) y el día 7 (35,78 ± 5,9 % COL1A1-EV MN frente a 19,38 ± 3,8 % de inyección con aguja, P < 0,001), que dura hasta el día 10 después de la inyección (30,22 ± 2,6 % COL1A1-EV MN frente a 6,68 ± 1,3 % de inyección con aguja, P < 0,001) (Fig. 5g, h). Los análisis de distribución de órganos ex vivo de la fluorescencia de la sonda DiI durante un período de 2 semanas revelaron una distribución tisular y una disminución de la señal similares entre los animales que recibieron inyección intradérmica y los animales que recibieron microagujas, lo que sugiere que la reducción en la intensidad de la señal se debe al metabolismo de la sonda DiI, como se muestra en otros estudios similares40,41 (Fig. 9a,b complementaria). En conjunto, estos hallazgos indican que el uso del parche de microagujas mejora la retención a largo plazo de los vehículos eléctricos en el tejido.

a, Ilustración esquemática de la fabricación de microagujas. b, Imágenes de microscopio y microscopía electrónica de barrido de conjuntos de microagujas. Barra de escala, 500 µm. c, la sección de piel de ratón teñida con H&E muestra la penetración de una sola microaguja. Barra de escala, 100 µm. d, Arriba: evolución temporal de las puntas de las microagujas HA EV presionadas en la piel; las microagujas se disolvieron a los 15 min de la aplicación. Barras de escala, 200 µm. Abajo: la recuperación de la piel después del tratamiento con microagujas HA EV muestra una irritación mínima. Barras de escala, 5 mm. e, la histología de la piel de los EV marcados con Dil muestra EV altamente concentrados (rojo) distribuidos de manera desigual en el tejido subcutáneo después de la inyección con aguja de jeringa, mientras que los EV administrados con microagujas se distribuyeron de manera más uniforme en el tejido. Las líneas discontinuas amarillas rodean los bulbos pilosos subcutáneos representativos y bordean porciones representativas en forma de varilla del folículo que se extienden hacia arriba hasta la dermis. Barra de escala, 100 µm. f, Distribución de EV representativa analizada por el software ImageJ. g, Imágenes de fluorescencia in vivo de ratones desnudos tratados con inyección intradérmica o administración de parches de microagujas HA de EV marcados con Dil en los días 1, 2, 4, 7, 10 y 14 después del parto (n = 3 para todos los grupos). h, Cuantificación de la intensidad de fluorescencia durante el período de tratamiento de 14 días. Los datos se normalizan a la intensidad de fluorescencia en el día 1. Todos los datos provienen de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem ***P < 0,001 COL1A1-EV Grupo de administración MN frente al grupo de administración con aguja. Se utilizó ANOVA de dos vías para las comparaciones en h. El esquema en a fue creado con BioRender.com.

A continuación, probamos si el uso de nuestro parche de microaguja COL1A1-EV personalizado para administrar COL1A1-EV podría dar como resultado un mejor reemplazo de proteínas in vivo en la piel de ratones fotoenvejecidos (Fig. 10 complementaria). Los ratones atímicos se sometieron nuevamente a 8 semanas de irradiación UV y se asignaron a 1 de 5 grupos de tratamiento: (1) control de solución salina, (2) EV de ARNm de COL1A1 administrados por aguja de jeringa, (3) control de microaguja de HA, (4) EV descargados administrados por Microaguja HA (microaguja EV descargada) y (5) EV cargados con ARNm de COL1A1 administrados por microaguja HA (COL1A1-EV MN). A todos los ratones se les administró una inyección de dosis única de 22 × 109 copias del ARNm de COL1A1 (o un volumen de vehículo equivalente para los grupos de control) en el día 0 de la línea de tiempo del tratamiento. Después de la inyección, todos los ratones fueron monitoreados mediante fotografías microscópicas de las arrugas de la piel dorsal hasta por 3 meses (Fig. 6a). En relación con la inyección con aguja de jeringa, que redujo la formación de arrugas hasta 35 días antes de volver a la línea de base previa al tratamiento, se descubrió que la administración de ARNm de COL1A1 por COL1A1-EV MN redujo sustancialmente el área y el número de arrugas hasta 70 días antes de volver a los niveles de referencia (Fig. 6b, c). Para confirmar aún más estos hallazgos, se sacrificó un subconjunto de ratones de cada grupo 1 mes, 2 meses y 3 meses después del tratamiento para la evaluación del yeso de réplica de piel de la piel dorsal y la histología (Datos extendidos Fig. 5a-c). Los tratamientos con inyección de aguja y COL1A1-EV MN redujeron la longitud y la profundidad de las arrugas hasta 1 mes después del tratamiento (datos extendidos, Fig. 5d, e). Sin embargo, solo los ratones tratados con COL1A1-EV MN mostraron reducciones significativamente duraderas en la longitud y profundidad de las arrugas hasta el punto de tiempo de 2 meses. Para probar si el reemplazo de colágeno y el tratamiento de las arrugas podrían mantenerse durante un período de tiempo más prolongado, sometimos a cohortes de animales adicionales a un tratamiento en serie de COL1A1-EV administrados con aguja de jeringa y microaguja cada 30 días. Se descubrió que tanto COL1A1-EV administrados con aguja de jeringa como COL1A1-EV MN redujeron el número y el área de las arrugas mientras los animales recibieron el tratamiento, y los animales COL1A1-EV MN demostraron la mayor mejora (datos ampliados, fig. 6).

a, Observación a largo plazo (91 días) de 4 grupos de tratamiento después de una única inyección: (1) control de solución salina, (2) COL1A1-EV (22 × 109 número de copias de ARNm de COL1A1) administrado con una aguja de jeringa de 28G, (3) HA control de microagujas, (4) EV descargados administrados por microagujas HA (microagujas EV descargadas) y (5) COL1A1-EV MN (22 × 109 número de copias COL1A1 mRNA), (n = 4 para todos los grupos). Barra de escala, 5 mm b, Cuantificación del número total de arrugas (n = 4 para todos los grupos; *P = 0,014 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 7; *P = 0,038 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 14; * P = 0,012 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 21; *P = 0,039 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 28; *P = 0,031 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 35; *P = 0,03 COL1A1-EV MN frente a Solución salina el día 42; *P = 0,022 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 49; *P = 0,031 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 56; **P = 0,008 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 63; #P = 0,030 inyección con aguja frente a solución salina el día 7; #P = 0,041 inyección con aguja frente a solución salina el día 14; †P = 0,047 microaguja HA frente a solución salina el día 14). c, Cuantificación del área total de arrugas de la piel dorsal (n = 4 para todos los grupos; *P = 0,016 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 7; *P = 0,038 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 14; *P = 0,042 COL1A1 -EV MN frente a solución salina los días 21 y 28; *P = 0,026 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 42; *P = 0,048 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 49; #P = 0,033 Inyección con aguja frente a solución salina el día 7 ; #P = 0,031 inyección con aguja frente a solución salina el día 14; #P = 0,042 inyección con aguja frente a solución salina el día 21). Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem. Se utilizó ANOVA de dos vías para las comparaciones en b y c.

El análisis histológico de las muestras de piel tomadas después del tratamiento confirmó el injerto duradero de la proteína GFP+ COL1A1 en la dermis y el subcutis de los ratones tanto en el grupo de inyección con aguja como en el grupo de microaguja COL1A1-EV 1 mes después del parto (Fig. 7a). Sin embargo, en el punto de tiempo de 2 meses, solo los ratones en la cohorte de microagujas COL1A1-EV demostraron injerto GFP+ COL1A1 en la dermis y subcutis (Fig. 7b). A los 3 meses después del parto, las muestras de piel en todos los grupos no mostraron ningún injerto de colágeno GFP (Fig. 7c). Se cuantificó la intensidad de la inmunofluorescencia COL1A1+ GFP, lo que respalda los hallazgos de microscopía de arrugas que demostraron un tratamiento eficaz en los días 30 a 60 y un retorno a la línea de base previa al tratamiento en los días 70 a 90 (Fig. 7d). La tinción inmunohistoquímica de la proteína COL1A1 y la tinción tricrómica de Masson de los tejidos de la piel confirmaron que la cantidad de colágeno en la dermis se correlacionó con los hallazgos de microscopía de inmunofluorescencia y que, entre todas las cohortes, el grupo COL1A1-EV MN tenía las fibras de colágeno más abundantes y el grosor dérmico más alto (180,14). ± 21,46 μm COL1A1-EV MN frente a 96,61 ± 14,00 μm de solución salina a 1 mes, P < 0,001; 154,88 ± 8,27 μm COL1A1-EV MN frente a 109,25 ± 10,86 μm de solución salina a 2 meses, P < 0,05) (Fig. 7e, f) . En conjunto, estos hallazgos indican que la encapsulación y la administración de ARNm de COL1A1 a través de nuestro sistema COL1A1-EV MN pueden prolongar el reemplazo de la proteína de colágeno en la piel fotoenvejecida durante más del doble de la duración de la administración con aguja de jeringa.

a–c La tinción de inmunofluorescencia de GFP y COL1A1 (RFP) demuestra injertos de proteína COL1A1 positivos para GFP en la piel de ratones que reciben COL1A1-EV mediante inyección con aguja 28G y mediante COL1A1-EV MN hasta 1 mes (28 días) después del parto. A los 2 meses (63 días), solo los ratones que fueron tratados con COL1A1-EV MN tenían un injerto de COL1A1 positivo para GFP a largo plazo. No se pudo detectar evidencia de proteína de colágeno positiva para GFP en ningún ratón 3 meses (91 días) después del parto. Barra de escala, 200 µm. d, la cuantificación de la señal de fluorescencia co-localizada de GFP y COL1A1 (RFP) demuestra el injerto de colágeno derivado de COL1A1-EV a largo plazo en la piel de ratones que recibieron COL1A1-EV MN frente a ratones que recibieron COL1A1-EV mediante inyección de aguja 28G y grupos de control ( n = 3 para todos los grupos; ***P < 0,001 COL1A1-EV MN frente a inyección con aguja a los 2 meses). e, Tinción inmunohistoquímica de la proteína COL1A1 y tinción tricrómica de Masson a 1 mes (28 d), 2 meses (63 d) y 3 meses (91 d). Barra de escala, 200 µm. f, Cuantificación del grosor dérmico mediante tinción tricrómica de Masson (n = 3 para todos los grupos; **P = 0,0062 COL1A1-EV MN frente a solución salina a 1 mes; *P = 0,034 COL1A1-EV MN frente a solución salina a 2 meses). Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sem Se utilizó ANOVA de dos vías para las comparaciones en d y f.

Las vesículas extracelulares han surgido como un sistema de administración de fármacos de próxima generación debido a sus propiedades inherentes de biocompatibilidad, baja inmunogenicidad y capacidad para derivar de células humanas sanas12. No obstante, la mayoría de los estudios centrados en la administración de ácidos nucleicos hasta el momento han encapsulado moléculas pequeñas en el rango de 10 a 20 nt, como los microARN y los ARN de interferencia pequeños (siARN) como carga útil, mientras que los ácidos nucleicos más grandes, como los ARNm, rara vez se evalúan debido a la dificultad de cargarlos en EVs42. Con el reciente avance en la utilidad de las terapias basadas en ARNm para el tratamiento de enfermedades humanas, ha aumentado el interés en el uso de vehículos eléctricos como sistema de administración de ARNm. Recientemente, desarrollamos una técnica de carga de ARNm que permite la producción a gran escala de vehículos eléctricos que contienen ARNm endógeno intacto para la terapia con ácidos nucleicos14. Aquí hemos demostrado que los vehículos eléctricos cargados de ARNm se pueden aplicar para la terapia de reemplazo de proteínas en un modelo de fotoagotamiento dérmico de colágeno17. Hemos demostrado que CNP es capaz de cargar un alto número de copias de ARNm de COL1A1 (~4000+ nt) en vehículos eléctricos, lo que no se puede lograr con métodos de carga posteriores a la inserción43,44. Los resultados in vivo mostraron que estos COL1A1-EV pueden restaurar la expresión de la proteína COL1A1 en la piel del ratón después del fotoenvejecimiento. También examinamos la presencia de ARNm y proteína de COL1A1 a lo largo del tiempo in vivo, y encontramos que la proteína correspondiente se tradujo tan pronto como 12 h después del parto con un pico a los 4 días, y que esto se mantuvo durante varias semanas, dependiendo de la dosis. Varios estudios han generado proteína COL1A1 ex vivo como relleno de colágeno; aquí caracterizamos la cinética in vivo del suministro de ARNm de COL1A1 exógeno y la expresión de proteínas in vivo45.

Para adaptar nuestro enfoque para el reemplazo de proteínas a largo plazo, desarrollamos aún más una matriz de microagujas para la entrega de COL1A1-EV para permitir una distribución uniforme de los EV en el tejido local, con una ruptura de membrana reducida. HA es un elemento crítico de la matriz extracelular y se ha verificado que tiene una excelente biocompatibilidad con los tejidos de la piel y varios sistemas de biomateriales46,47. Mediante la integración de EV en un biomaterial de microagujas de HA, pudimos extender el injerto de proteína de COL1A1 a más de 60 días en las muestras de piel evaluadas. En particular, los EV no cargados con el ARNm de COL1A1 también pudieron lograr una disminución modesta en el número de arrugas, lo que es consistente con los estudios que encontraron que los EV 'vacíos' de ciertas células parentales son candidatos terapéuticos potenciales debido a las cargas endógenas (aún así, los mecanismos detallados subyacentes tales fenómenos necesitan mayor exploración)36.

En comparación con la expresión relativamente duradera de las terapias génicas basadas en ADN, las terapias de ARNm pueden ayudar a avanzar en la terapia génica y reducir los riesgos de eventos adversos debido a la retención de los ARNm en el citoplasma, sin penetración en el núcleo48,49. Por lo tanto, las modalidades basadas en ARNm tienen ventajas sobre las terapias génicas basadas en virus y ADN, como la capacidad de eludir el proceso de transcripción tradicional y ningún riesgo de integración genómica (a diferencia del uso de algunos vectores de virus adenoasociados, que tradicionalmente se ha considerado de bajo perfil de riesgo50). Sin embargo, la traducción clínica de las terapias de ARNm todavía es limitada. Para los productos de ARNm desarrollados con LNP, la inmunogenicidad de los componentes de PEGilación en la superficie de LNP, así como algunas formulaciones de vehículos, se han relacionado con la inflamación y numerosos eventos adversos de seguridad51,52. De hecho, cuando comparamos la administración de COL1A1-LNP y COL1A1-EV in vivo, encontramos que COL1A1-LNP pudo producir proteína de colágeno y reducir las arrugas dérmicas, pero también causó un infiltrado inflamatorio notable en el tejido local, mientras que COL1A1-EV no lo hizo. no. Varios estudios recientes han demostrado que los EV se caracterizan por bajos niveles de inmunogenicidad, con algunos informes preclínicos y ensayos clínicos (clinicaltrials.gov: NCT05191381, NCT05216562) que sugieren que los EV derivados de una variedad de tipos de células tienen efectos inmunosupresores, aunque debe tenerse en cuenta que estos estudios utilizaron principalmente células estromales mesenquimales y células dendríticas como tipos de células donantes36,53,54.

Los desafíos futuros para la aplicación clínica de COL1A1-EV MN incluyen la optimización de la geometría de microagujas con EV más densamente protegidos, así como condiciones de almacenamiento optimizadas porque el ARNm está sujeto a una rápida degradación cuando no se retiene a -80 °C o menos55. Idealmente, los futuros sistemas EV pueden empaquetarse como alícuotas listas para usar y enviarse a las temperaturas adecuadas, lo que mejoraría en gran medida la viabilidad de los sistemas COL1A1-EV MN para uso clínico. También intentaríamos expandir las aplicaciones terapéuticas en nuestro sistema para incluir elementos como COL7 para enfermedades genéticas huérfanas como la epidermólisis ampollosa56. Solo hemos administrado ARNm a través del sistema de microagujas, pero el sistema también es adecuado para envasar otros tipos de cargas de vehículos eléctricos, como miARN y siARN, y otros agentes terapéuticos bioactivos, como péptidos y proteínas57,58,59. Aunque sería necesario superar muchos desafíos antes de que el sistema de administración de EV basado en microagujas pueda probarse en humanos, debido a la biocompatibilidad mejorada y al perfil de efectos secundarios benignos de los EV en comparación con los LNP y el virus adenoasociado (AAV), creen que el sistema podría constituir un portador universal de ácido nucleico para el tratamiento de una variedad de enfermedades y afecciones humanas.

Los nHDF (PCS-201-010) se compraron de ATCC y se cultivaron en medio DMEM (Thermo Fisher) que contenía un 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS; 10099141C, Thermo Fisher) a 37 °C en condiciones de humedad equilibradas con un 5 % de CO2 .

Para CNP, se sembró una sola capa de nHDF en una superficie de CNP 3D de 1 cm × 1 cm para la incubación durante la noche como se describió anteriormente. El plásmido de ADNc COL1A1 humano (NM_000088.3) con etiqueta GFP se adquirió de Sino Biological (HG11776-ACG). Los plásmidos precargados en tampón PBS se inyectaron en células individuales a través de nanocanales utilizando una intensidad de campo eléctrico de 250 V cm−1 con 10 pulsos a 10 ms por pulso, con un intervalo de 0,1 s. Se probaron varias condiciones de electroporación para determinar las condiciones óptimas. BEP (gene pulser xcell, Bio-rad) se realizó utilizando una intensidad de campo eléctrico de 1250 V cm−1 con 1 pulso de 20 ms. Los plásmidos pCMV-COL1A1-GFP se prepararon a una concentración de 500 ng ml-1 en PBS para la transfección.

Las células se cultivaron en medio DMEM que contenía suero. El medio de cultivo celular que contenía suero se eliminó al realizar CNP. Luego, las células se lavaron con PBS 3 veces y se cultivaron en medio de cultivo celular sin suero durante 24 h después de CNP. Los vehículos eléctricos se recogieron de sobrenadantes de cultivos celulares. En resumen, el medio de cultivo celular (CCM) se centrifugó a 200 × g durante 5 min para eliminar las células y los desechos, después de lo cual se centrifugó nuevamente a 2000 × g durante 30 min. Se usó la unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 (10 kDa, Millipore, 801024) para concentrar el CCM. La muestra de EV se purificó usando un reactivo de aislamiento de exosomas totales (Invitrogen, 4478360). El tamaño y el número de partículas EV se midieron utilizando NanoSight NS300 (Malvern). El rendimiento de ARN y la distribución de tamaños se analizaron utilizando un bioanalizador Agilent 2100 con un kit RNA 6000 Pico (Agilent Technologies).

La expresión del ARNm de COL1A1 humano en vehículos eléctricos se midió mediante RT-qPCR siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. En resumen, el ARN total de los vehículos eléctricos purificados se obtuvo utilizando un mini kit de purificación de ARN (Norgen Biotek, 55000) y un kit de eliminación de ADN (Norgen Biotek, 25720). Se utilizó un sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III (Invitrogen) para sintetizar el ADN complementario de primera cadena, con hexámeros aleatorios como cebadores. La expresión de los genes se midió usando TB Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820). Las secuencias de cebadores utilizadas fueron las siguientes: COL1A1 (humano), directa: 5′-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3′ e inversa: 5′-ACCATCCAAACCACTGAAAC-3′; Gapdh (humano), adelante: 5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA - 3′ y atrás: 5′ - AGAGGCAGGGATGATGTTCT - 3′ (Tabla complementaria 1).

Se anestesiaron ratones desnudos hembra (de 10 a 12 semanas de edad) con isoflurano y se inyectó en la región dorsal de la piel 50 μl, 2,7 × 109, número de copias de EV de ARNm de CNP COL1A1. En puntos de tiempo predefinidos (12, 24, 48, 96 h, 7 d, 10 d, 14 d) después de la inyección en la piel, se extirpó la piel y se colocó en formaldehído al 4% para la fijación. Posteriormente, los cortes se incluyeron en parafina y luego se seccionaron en cortes de 4 μm. El ensayo de hibridación in situ automatizado RNAscope para la detección de ARNm de COL1A1 humano se realizó utilizando el sistema de hibridación HybEZ II (Advanced Cell Diagnostics (ACD)), y todos los reactivos de hibridación in situ eran productos ACD. En resumen, la recuperación del objetivo se realizó a 95 °C durante 15 min utilizando Leica Epitope Retrieval Buffer 2, seguida de un tratamiento con proteasa a 42 °C durante 15 min. La sonda (RNAscope Probe-Hs-COL1A1, 401891, ACD) se hibridó durante 2 horas a 40 °C, seguida de una amplificación del alcance del ARN, y se utilizó el kit RNAscope 2.5 HD Assay BROWN para visualizar la tinción. Se utilizó la sonda RNAscope 2.5 LS-Rn-Ppib como control negativo.

Las secciones de tejido se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con PBS (Vetec) durante 5 min cada una. Luego, el tejido se transfirió a Triton X-100 al 0,2 % durante 15 min (permeabilizado), seguido de bloqueo con BSA durante 40 min y la adición de anticuerpo primario (ab34710 y ab6556, Abcam) para el bloqueo durante la noche a 4 °C. Finalmente, se añadió el anticuerpo secundario (ab6939 y ab6717, Abcam) y las secciones de tejido se colocaron a temperatura ambiente durante 60 min. A continuación, las secciones de tejido se lavaron con PBS, se añadió DAPI (ThermoFisher) para tinción nuclear y luego se montaron para observación.

Las secciones de tejido se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 min, se lavaron 3 veces con PBS (pH 7,4) durante 5 min cada una y luego se transfirieron a una caja de recuperación que contenía solución de recuperación de antígeno de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (pH 9,0) para la recuperación de antígeno en un horno microondas. Posteriormente, las secciones se incubaron en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% a temperatura ambiente durante 25 min en la oscuridad. Después de lavar con PBS, el tejido se cubrió uniformemente con BSA al 3 % o suero de conejo normal al 10 %, se bloqueó a temperatura ambiente durante 30 min, se le añadió el anticuerpo primario (ab34710 y ab6556, Abcam) y se incubó durante la noche a 4 °C. Luego, se agregó un anticuerpo secundario (marcado con HRP) correspondiente al anticuerpo primario para cubrir las secciones de tejido, que luego se incubaron a temperatura ambiente durante 50 min. Para el desarrollo del color con 3,3'-diaminobencidina (DAB), los portaobjetos se colocaron en PBS (pH 7,4) y se lavaron 3 veces con agitación en un agitador de decoloración durante 5 min cada vez. Después de que las rebanadas se secaron ligeramente, se añadió gota a gota en el círculo la solución de desarrollo de color DAB recién preparada. El tiempo de revelado se controló bajo el microscopio. Se añadieron secuencialmente hematoxilina, solución de diferenciación de hematoxilina y solución de retorno de azul de hematoxilina para la contratinción de los núcleos. Finalmente, los portaobjetos de vidrio se colocaron en etanol anhidro y xileno para su deshidratación y sellado.

El trabajo con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen (No. D2021-107) o laboratorios asociados. Para crear el modelo de fotoenvejecimiento de la piel, se sometió a ratones desnudos hembra (de 10 a 12 semanas de edad) a radiación UVB de la piel dorsal cada dos días durante 8 semanas de la siguiente manera: los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1,5 % y luego se administró radiación UV con una lámpara UV (Philips; espectro de emisión 311 nm) colocada 30 cm por encima de la piel dorsal de los ratones cada dos días durante 8 semanas. La intensidad de la radiación UV, representada como la dosis eritemal mínima (MED), se fijó en 1 MED durante las primeras 2 semanas (60 mJ cm−2), se elevó a 2 MED (120 mJ cm−2) en la tercera semana, 3 MED (180 mJ cm-2) en la cuarta semana y 4 MED (240 mJ cm-2) durante la quinta a la octava semana del experimento. El volumen total de UVB irradiado fue de aproximadamente 80 MED. Para el tratamiento con jeringa de la piel fotoenvejecida, los ratones desnudos, después del período de irradiación de 8 semanas descrito anteriormente, se asignaron a 1 de 6 grupos de tratamiento (4 ratones cada uno): (1) irradiación UVB + solución salina, (2) irradiación UVB + Ácido retinoico al 0,05 %, (3) irradiación UVB + nHDF-EV descargados administrados con una jeringa Hamilton 32G, (4) irradiación UVB + 2,7 × 109 número de copias COL1A1 mRNA COL1A1-LNP, (5) irradiación UVB + 2,7 × 109 número de copias COL1A1 mRNA COL1A1- EV entregados con una jeringa Hamilton 32G y (6) sin exposición a UVB (falsa). Los tratamientos de la piel se realizaron los días 0, 4, 7, 14 y 21. Toda la piel de la espalda se dividió en tres partes para el análisis.

Se adquirió una réplica de silicona SILFLO y un localizador de anillos de Clinical & Derm. Se obtuvieron réplicas de la piel de la espalda (dorsal) de los ratones al final del período de tratamiento. Las réplicas se analizaron mediante estereomicroscopía (Olympus SZX7) y las imágenes correspondientes se analizaron mediante ImageJ (NIH).

La fabricación del parche de microagujas se realizó utilizando un micromolde de silicona, con cada cavidad de aguja con un diámetro de base redonda de 400 μm y una altura de 1000 μm. Estas cavidades de aguja se dispusieron en una matriz de 10 × 10 con un espacio de punta a punta de 700 μm. Para la preparación del parche de microagujas, se mezclaron 150 μl de solución de HA al 15 % en peso con 50 μl de EV, se mantuvieron al vacío durante 30 min y luego se transfirieron a 4 °C hasta que se depositaron en la cavidad de la aguja. Finalmente, se cargó 1 ml de solución de HA al 15 % en peso en el micromolde y se colocó el micromolde en un arcón de secado con un ventilador adjunto para acelerar el proceso de evaporación para la solidificación. Después de la solidificación, el parche de microagujas se separó del molde de silicona para su uso posterior. Para evaluar la entrega de COL1A1-EV a través de los parches de microagujas personalizados, los ratones desnudos se irradiaron durante 8 semanas como se describe anteriormente y se asignaron a 1 de 5 grupos de tratamiento (4 ratones cada uno): (1) irradiación UVB + solución salina, (2) irradiación UVB + 22 × 109 número de copia COL1A1 mRNA COL1A1-EV administrados por jeringa Hamilton 28G, (3) irradiación UVB + parche de microaguja HA, (4) irradiación UVB + 1010 nHDF-EV descargados administrados mediante microaguja (microaguja EV descargada) y (5) UVB irradiación + microaguja HA al 15% mezclada con 22 × 109 número de copia COL1A1 mRNA COL1A1- EV.

Se tomaron imágenes de ratones tratados con microagujas con un sistema de imágenes in vivo (IVIS Spectrum, Perkin Elmer) los días 1, 2, 4, 7, 10 y 14. Los parámetros se establecieron de la siguiente manera: tiempo de exposición 15 s, excitación 570 nm, emisión 680 nm, 2F/stop y campo de visión de 13,6 cm en los tiempos de imagen de fluorescencia especificados. El análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia de RFP se realizó midiendo la eficiencia de radiación promedio (fotón s-1 cm-2 sr-1 µW-1) en una región de interés. Los datos se normalizaron a la intensidad de fluorescencia el día 1.

Los datos cuantitativos se representan como media ± sem. No se excluyeron datos en este estudio. Para analizar la diferencia estadística entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de Student bilaterales para las comparaciones. Para dos o más grupos, se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey para analizar la diferencia estadística. Se eligió ANOVA de dos vías para analizar la diferencia estadística entre puntos de datos en grupos. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se utilizó GraphPad Prism 8.3 para el análisis de datos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los principales datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos de origen de las cifras están disponibles en figshare en https://figshare.com/articles/dataset/SD_FIGS_xlsx/21514641. Los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio están disponibles para fines de investigación de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Agradecemos a C. Wogan de la División de Oncología Radioterápica del MD Anderson Cancer Center por su asistencia editorial.

Estos autores contribuyeron por igual: Yi You, Yu Tian y Zhaogang Yang.

Escuela de Graduados de Shenzhen de la Universidad de Pekín, Shenzhen, China

Yi You, Yu Tian, ​​Yuhao Tong, Andreanne Poppy Estania, Jianhong Cao, Wei-Hsiang Hsu, Yutong Liu & Andrew S. Lee

Instituto de Investigación del Cáncer, Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, Shenzhen, China

Yi You, Yu Tian, ​​Yuhao Tong, Andreanne Poppy Estania, Jianhong Cao, Wei-Hsiang Hsu, Yutong Liu & Andrew S. Lee

Departamento de Oncología Radioterápica, Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas, Houston, TX, EE. UU.

Zhaogang Yang, Benjamin R. Schrank, Jong Hoon Ha, Shiyan Dong, Xuefeng Li, Yifan Wang y Wen Jiang

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Jilin, Changchun, China

Zhaogang Yang, Ziwei Li, Yarong Zhao, Huan Zhang y Lesheng Teng

Spot Biosystems Ltd., Palo Alto, CA, EE. UU.

Junfeng Shi, Kwang Joo Kwak y Ly James Lee

Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Chi Ling Chiang

Departamento de Neurocirugía, Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas, Houston, TX, EE. UU.

Kristin Huntoon, DaeYong Lee, Thomas D. Gallup y Betty YS Kim

el Sexto Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, el Hospital Popular de Qingyuan; Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Respiratorias, Instituto Chino-Francés Hoffmann, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Médica de Guangzhou, Guangzhou, China

Xuefeng Li

Hospital Fuwai Academia China de Ciencias Médicas Shenzhen, Laboratorio Clave de Enfermedades Cardiovasculares de Shenzhen, Laboratorio Clave Estatal de Enfermedades Cardiovasculares y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Shenzhen, China

Wen-Jing Lu y Feng Lan

Laboratorio de Beijing para Medicina de Precisión Cardiovascular, Laboratorio Clave de Ingeniería Biomédica para la Investigación de Enfermedades Cardiovasculares, Laboratorio Clave de Enfermedades Cardiovasculares Relacionadas con la Remodelación, Ministerio de Educación, Hospital Anzhen de Beijing, Universidad Médica Capital, Beijing, China

Wen-Jing Lu

Departamento de Dermatología, Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN, EE. UU.

Eman Bahrani

Centro de Tumores Cerebrales, Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas, Houston, EE. UU.

Kristin Huntoon, DaeYong Lee, Thomas D. Gallup y Betty YS Kim

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ASL y FL concibieron el trabajo; ASL, WJ, FL, ZY y BYSK supervisaron la investigación; ASL, JS, LJL y KJK desarrollaron la tecnología; ASL, YY, YT, FL, WJ, ZY, LT y BYSK diseñaron los experimentos; ASL, LJL, ZY, YT, YY, WJ, FL, BYSK, KJK, JS, BS, KH, DL, TG, LT, W.-JL y EB proporcionaron información intelectual; ASL, LJL, ZY, WJ, JS, SD, EB y BYSK escribieron el manuscrito, con aportes de todos los autores; YY, YT, JS, KJK, YT, APE, JC, C.-LC, W.-HHYL, ZL, YZ, HZ, XL, YW y JH realizaron experimentos; YY, YT, ZY y APE prepararon figuras y videos.

Correspondencia a Feng Lan, Betty YS Kim o Andrew S. Lee.

ASL y LJL son consultores y accionistas de Spot Biosystems, Ltd. JS y KJK son empleados de Spot Biosystems, Ltd.

Nature Biomedical Engineering agradece a Sun Hwa Kim, Chuanbin Wu y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Imágenes de fluorescencia de nHDF privados de suero tratados con EV de COL1A1-GFP y proteína traducida del ARNm de COL1A1-GFP entregado después de 48 h. Barra de escala, 100 µm. b, Intensidad de fluorescencia de las células tratadas con COL1A1-EV (n = 3 para todos los grupos, *** P < 0,001 Control frente a COL1A1-EV) en 48 h. c, RT-qPCR muestra niveles más altos de transcripción de ARNm de colágeno después de la entrega in vitro de ARNm de COL1A1 de EV (n = 3 para todos los grupos, ***P < 0,001 Control frente a COL1A1-EV) en 48 h. d, las transferencias Western muestran una proteína COL1A1 elevada en los fibroblastos tratados (n = 3 para todos los grupos, **P = 0,001 Control frente a COL1A1-EV).e, Pro-colágeno I recolectado del sobrenadante y detectado por ELISA (n = 3 para todos grupos, ***P < 0,001 Control vs COL1A1-EVs) en 48 h. Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± SEM; Se utilizaron pruebas de la t de Student de dos colas para las comparaciones en (b–e).

a, Observaciones microscópicas de piel dorsal y réplicas de piel. Barra de escala, 5 mm. b, profundidad media de las arrugas en réplicas de piel (n = 4 para todos los grupos, ※※※P < 0,001 COL1A1-EV frente a solución salina; **P = 0,0025 COL1A1-LNP frente a solución salina; +++P < 0,001 COL1A1-EV frente a COL1A1 -LNP). c, Longitud media de las arrugas analizada en réplicas de piel (n = 4 para todos los grupos, #P = 0,0203 EV descargados frente a solución salina; *P = 0,0405 COL1A1-LNP frente a solución salina; ※※※P < 0,001 COL1A1-EV frente a solución salina; ++ P = 0,0015 COL1A1-EV frente a COL1A1-LNP). Todos los datos proceden de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± SEM. Se usó el análisis de varianza de una vía (ANOVA) para las comparaciones en (b, c). NS, no significativo.

a, Las muestras de piel de los ratones a los que se les inyectó una dosis única de ARNm de COL1A1 con número de copia 22E9 en COL1A1-EV y COL1A1-LNP se recolectaron después de 24 h. Se analizaron muestras de piel de ratones mediante citometría de flujo, para b, porcentaje de células leucocitarias, y c, porcentaje de neutrófilos (n = 3 para todos los grupos, **P = 0,0034 COL1A1-LNPs vs simulado para % de células CD45+; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Sham para % de neutrófilos entre células CD45+; NS, no significativo). d, la cuantificación de proteínas mediante ELISA para IFN-γ, IL-1β, IL-6 y TNF-α muestra una elevación de las citocinas inflamatorias en el grupo COL1A1-LNP en comparación con COL1A1-EV (n = 3 para todos los grupos, **P = 0,0074 COL1A1-LNPs vs Sham para IFN-γ; #P = 0.0333 COL1A1-EVs vs Sham y ***P < 0.001 COL1A1-LNPs vs Sham para IL-1β; ***P < 0.001 COL1A1-LNPs vs Sham para IL-6; *P = 0,0146 COL1A1-LNPs vs Sham para TNF-α; NS, no significativo). e, imágenes de inmunotinción representativas para TNF-α y (f) IL-6 después de inyectar COL1A1-EV y COL1A1-LNP. Barra de escala, 100 µm. Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional para las comparaciones en (b-d).

a, las arrugas se rastrearon los días 0, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 días después de los tratamientos indicados (5 inyecciones de dosis baja de COL1A1-EV (2.7E9 número de copia COL1A1 mRNA) , COL1A1-LNP (2.7E9 número de copia COL1A1 mRNA), EV descargados, ácido retinoico al 0,05 % [RA], solución salina). n = 4, Barra de escala, 5 mm. Los ratones desnudos hembra que no fueron expuestos a los rayos UV comprendían el grupo simulado. b, Número de arrugas en la piel dorsal de los ratones a lo largo del tiempo. (n = 4 para todos los grupos; **P = 0,008 COL1A1-EVs frente a solución salina el día 7; **P = 0,004 COL1A1-EVs frente a solución salina el día 21, **P = 0,001 COL1A1-EVs frente a solución salina el día 35; ***P < 0,001 COL1A1-EVs frente a solución salina los días 14, 28, 42 y 49; †P = 0,025 RA frente a solución salina el día 21; ††P = 0,007 RA frente a solución salina el día 28; ##P = 0,0071 EV descargados frente a solución salina el día 14; ##P = 0,004 EV descargados frente a solución salina el día 21; ##P = 0,002 EV descargados frente a solución salina el día 28; #P = 0,015 EV descargados frente a solución salina el día 35; ※※P = 0,0053 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 14; ※※P = 0,0041 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 21; ※P = 0,017 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 28; ※P = 0,022 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 35) . c, Área total de arrugas (n = 4 para todos los grupos, *P = 0,012 COL1A1-EV frente a solución salina el día 7; ***P < 0,001 COL1A1-EV frente a solución salina los días 14, 21, 28 y 35; *P = 0,015 COL1A1-EV frente a solución salina el día 42; ††P = 0,008 RA frente a solución salina el día 14; ††P = 0,007 RA frente a solución salina los días 21 y 35;††P = 0,005 RA frente a solución salina el día 28; #P = 0,012 EV descargados frente a solución salina el día 14; #P = 0,035 EV descargados frente a solución salina el día 21; ##P = 0,002 EV descargados frente a solución salina el día 28; ※P = 0,062 COL1A1-LNP frente a solución salina el día 14; ※P = 0,039 COL1A1-LNPs frente a solución salina el día 21; ※※P = 0,0027 COL1A1-LNPs frente a solución salina el día 28; ※※P = 0,046 COL1A1-LNPs frente a solución salina el día 35). Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± SEM. Se usó ANOVA de dos vías para las comparaciones en (b, c).

a–c, Observación microscópica de la piel dorsal y la réplica de la piel al mes, 2 meses y 3 meses después del tratamiento. Barra de escala, 5 mm. d, e Cuantificación de la longitud media de las arrugas (n = 4 para todos los grupos, ***P < 0,001 COL1A1-EV MN frente a solución salina al mes y a los 2 meses; ###P < 0,001 Inyección con aguja frente a solución salina al mes; † †P = 0,031 HA MN frente a solución salina al mes;※※P = 0,029 EV MN sin carga frente a solución salina al mes) y profundidad media de las arrugas (n = 4 para todos los grupos, ***P < 0,001 COL1A1-EV MN frente a solución salina a 1 mes; **P = 0,001 COL1A1-EV MN frente a solución salina a los 2 meses; inyección con aguja frente a solución salina no significativa a 1 mes; HA MN frente a solución salina no significativa a 1 mes) de réplicas de piel. Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± SEM. Se usó ANOVA de dos vías para las comparaciones en (d, e).

a, Después de 8 semanas de fotoenvejecimiento irradiado con UV, se rastrearon las arrugas de los ratones tratados cada 30 días con 1) solución salina, 2) COL1A1-EV y 3) COL1A1-EV MN los días 0, 4, 7, 14, 21, 28 , 49, 70 y 91 (COL1A1-EVs, COL1A1-EV MN, solución salina). n = 4, Barra de escala, 5 mm. b, Número total de arrugas (n = 4 para todos los grupos; *P = 0,019 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 4; #P = 0,034 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,031 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 7 ; #P = 0,030 COL1A1-EVs frente a solución salina, **P = 0,008 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 14; **P = 0,008 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 21; *P = 0,025 COL1A1-EV MN frente a Solución salina el día 28; **P = 0,006 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 35; #P = 0,031 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,030 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 42; #P = 0,044 COL1A1- EV frente a solución salina, *P = 0,016 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 49; *P = 0,016 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 56; #P = 0,017 COL1A1-EV frente a solución salina, *P = 0,020 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 63; *P = 0,018 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 70; #P = 0,011 COL1A1-EVs frente a solución salina, **P = 0,006 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 77; #P = 0,028 COL1A1 -EVs frente a solución salina, *P = 0,037 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 84; #P = 0,043 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,043 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 91) y c, área de arrugas en el piel dorsal de los ratones durante la ventana de estudio de 90 días (n = 4 para todos los grupos; #P = 0,012 COL1A1-EVs frente a solución salina, **P = 0,005 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 7; #P = 0,010 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,048 COL1A1-EV MN frente a solución salina en el día 14; #P = 0,023 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,021 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 21; *P = 0,022 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 28; *P = 0,046 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 35; #P = 0,019 COL1A1-EVs frente a solución salina, **P = 0,009 COL1A1-EV MN frente a solución salina en el día 42; #P = 0,042 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,030 COL1A1-EV MN frente a solución salina en el día 49; *P = 0,030 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 63; *P = 0,029 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 70; #P = 0,048 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,022 COL1A1-EV MN frente a solución salina en el día 77; #P = 0,040 COL1A1-EVs frente a solución salina, *P = 0,027 COL1A1-EV MN frente a solución salina en el día 84; *P = 0,045 COL1A1-EV MN frente a solución salina el día 91). Todos los datos son de tres experimentos independientes y se presentan como medias ± SEM. Se usó ANOVA de dos vías para las comparaciones en (b, c).

Métodos complementarios, resultados y discusión, materiales, figuras, tablas y referencias.

Microagujas que liberan HA EV en la piel del ratón.

Evolución temporal ex vivo de la disolución de las puntas de las microagujas que administran HA EV en la piel.

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Reimpresiones y permisos

Tú, Y., Tian, ​​Y., Yang, Z. et al. Vesículas extracelulares que encapsulan el ARNm administradas por vía intradérmica para la terapia de reemplazo de colágeno. Nat. biomedicina ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

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Recibido: 01 Abril 2022

Aceptado: 18 de noviembre de 2022

Publicado: 12 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

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